Nereis. Interdisciplinary Ibero-American Journal of Methods, Modelling and Simulation.

Introducción

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es una antropozoonosis parasitaria que afecta principalmente a 21 países latinoamericanos. Sin embargo, a raíz de la migración, ha traspasado esas barreras; siendo actualmente un problema de salud global. Está clasificada por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad tropical desatendida, existiendo alrededor de 7 millones de infectados y 70 millones de personas en peligro de contraerlo [1]. Los niños y las personas que residen en áreas rurales en condiciones de pobreza constituyen la población de mayor riesgo.

Es causada por el protozoo flagelado hemotisular Trypanosoma cruzi y es transmitida por insectos vectores de la familia de los triatominos [2]. Cuando el vector se alimenta de la sangre humana, excreta heces que contienen los tripomastigotes metacíclicos infectantes. Tras el rascado, esas heces entran en contacto con la herida de la picadura, por lo que los tripomastigotes penetran en el torrente sanguíneo. Los tripomastigotes entran en ciertas células y se transforman en amastigotes que se dividen por fisión binaria y producen más amastigotes y finalmente tripomastigotes, que vuelven al torrente sanguíneo manteniendo el ciclo reproductivo del parásito [3]. Aunque la transmisión vectorial es la forma de adquisición más frecuente, también ha de mencionarse la transmisión vertical [4], endovenosa [5] y oral [2].

La enfermedad tiene tres fases principales: la aguda, con presencia de parásitos en la circulación periférica; la fase crónica asintomática, que puede durar decenas de años o toda la vida; y la fase crónica sintomática. Aunque la primoinfección suele ser asintomática, puede manifestarse en ciertos casos como un chagoma o signo de Romaña. Otras presentaciones clínicas de la fase aguda, así como también de la reactivación chagásica, incluyen: fiebre, linfoadenopatías, hepatoesplenomegalia y meningoencefalitis, entre otras. Dentro de las patologías asociadas a la fase crónica sintomática se hace mención de: miocardiopatías, arritmias, megacolon o megaesófago [2].

El benznidazol y el nifurtimox son dos fármacos disponibles frente a Chagas utilizados principalmente durante la fase aguda y la crónica asintomática. Su rol en la fase crónica sintomática es discutida y controversial, ya que a medida que avanza la enfermedad van perdiendo efectividad [3,6-10]. Por otro lado, aun siendo el benznidazol un fármaco de preferencia, presenta un alto grado de toxicidad para el ser humano [11]. Para encontrar nuevos fármacos efectivos y seguros, se han realizado numerosos estudios, algunos de los cuales involucran al posaconazol y otros inhibidores del ergosterol [12-15]. A pesar de ello, ninguno se encuentra validado para su uso frente a la enfermedad de Chagas.

Mediante la aplicación de la topología molecular, TM, se pueden crear modelos que permiten predecir la actividad de ciertos compuestos. La TM está relacionada con la teoría de grafo, siendo este último una figura que cuenta con vértices y aristas. Se representa una molécula como grafo con sus átomos como sus vértices y los enlaces entre átomos como las aristas. De esta forma, se puede estudiar la conectividad de las moléculas y obtener así determinados índices topológicos sobre la base de las propiedades invariantes de los compuestos [16,17]. Los índices topológicos permiten predecir con precisión propiedades fisicoquímicas y biológicas de diversos grupos de compuestos. Es por esta razón que estas técnicas in silico basadas en los parámetros QSAR se emplean desde hace algunas décadas en el diseño y selección de nuevos compuestos activos. Contribuyen a la reducción de costos ya que permiten una adecuada y rápida selección de compuestos potencialmente candidatos a fármacos en ensayos clínicos. Se han utilizado en diferentes áreas terapéuticas, particularmente en la parasitaria [18-23]. Se describen, por ejemplo, estudios con aplicación de la topología molecular para la predicción de la actividad frente a Trypanosoma cruzi de compuestos derivados nitrotriazoles [22]. Melo-Filho et al. (2019), por otro lado, realizaron mediante parámetros de relación cuantitativa de la estructura-actividad o quantitative structure-activity relationship (QSAR) un filtrado de compuestos citotóxicos y con actividad antitripanosomal ante células de mamíferos; obteniendo 39 posibles compuestos activos de 1.063.926 evaluados [12].

En este trabajo, se describe la elaboración de un modelo topológico-matemático de predicción QSAR usando la topología molecular, el análisis lineal discriminante (ALD) y el análisis de regresión multilineal. El objetivo de este estudio es aplicar la topología molecular con el fin de predecir la actividad antitripanosomal de un compuesto en dos etapas. En primer lugar, se intenta crear un modelo que pueda predecir si un compuesto desconocido es activo o no como citotóxico y antitripanosomal basándonos en el valor de sus descriptores topológicos. Para ello, se busca una función discriminante (FD) obtenida mediante un análisis lineal discriminante (ALD). En segundo lugar, se intenta buscar un modelo de predicción de la potencia de esa actividad mediante el valor de pEC50 predictivo, aplicando un modelo de regresión multilineal. Por último, gracias a los dos modelos de predicción obtenidos, se realizará un screening de moléculas análogas a los tres compuestos más activos de Melo-Filho et al. (2019) [12]. De esta manera podemos proponer nuevos compuestos potencialmente activos frente a la actividad que buscamos a fin de poder analizarlas experimental y eficazmente a posteriori, confirmando o refutando la predicción.

MATERIALES Y MÉTODOS

Compuestos analizados y ensayos realizados

Para este estudio se seleccionaron 39 compuestos considerando, como referencia, el fármaco benznidazol, que presenta una concentración media máxima eficaz (EC50) de 3,1 µM. De estos compuestos varios presentaron propiedades para combatir la enfermedad de Chagas, comprobadas experimentalmente en estudios previos, por lo que se dispone de sus respectivos valores de concentración EC50 (µM), así como de su estructura química (tabla 1).

Cabe señalar que se ha mantenido la misma numeración de cada molécula con respecto al trabajo original de donde fueron tomados los compuestos que aparecen en la tabla 1.

Descriptores moleculares

Para dibujar la estructura química de las moléculas se utilizó el software ChemDraw^®Professional 15.1. Una vez obtenido el gráfico de la estructura química, se importaron las moléculas al software Dragon^® [24] y se obtuvieron 583 índices topológicos (IT), tales como: índices de conectividad Randić, Kier y Hall (^mχt , mχ^vt) [25] e índices topológicos de carga (ITC) (GGi, JGi) [26]. También se obtuvieron, cocientes y diferencias entre índices de conectividad de valencia y no valencia (^mCt = ^mχt / mχ^vt y ^mDt = ^mχt - ^mχ^vt), el índice de Wiener (W) [27], y descriptores constitucionales sencillos como el número de vértices (N), longitud del grafo (L) y número de ramificaciones (R).

Análisis discriminante

El análisis lineal discriminante (ALD) es un algoritmo que nos permite distinguir entre dos o más categorías u objetos por medio de una función lineal. En nuestro caso, se trata de diferenciar o discriminar entre compuestos activos e inactivos según los valores de los descriptores de sus moléculas [28].

En este estudio, el grupo activo lo conforman compuestos con probada actividad antitripanosomal y con EC₅₀ < 10μM. En cambio, el grupo inactivo se compone de los compuestos con un EC₅₀ > 10μM. La capacidad discriminante se determinó en función del porcentaje de compuestos clasificados correctamente dentro de cada grupo.

La selección de los descriptores se basó en el parámetro de distribución Fisher-Snedecor (F), y el criterio de clasificación empleado fue la distancia de Mahalanobis. Se clasificó como activo o inactivo cualquier compuesto en función de su distancia más corta al centroide correspondiente [29]. El programa estadístico selecciona las variables para el cálculo de la función discriminante (FD) de manera sucesiva (stepwise), es decir, revisa todas las variables y la que contribuya más a la discriminación de los grupos será incluida en el modelo, mientras que la variable que menos contribuya a la predicción será eliminada. Por otra parte, para evaluar la calidad de la función discriminante se empleó el parámetro λ de Wilks, utilizando la prueba de igualdad de las medias de grupo para evaluar si las variables introducidas tienen poder discriminante [30]. De la misma manera, se evaluaron de forma sencilla la calidad de la función discriminante aplicándola a una prueba de validación interna del tipo leave some out.

Una vez seleccionada la función discriminante (FD), se realiza el diagrama de distribución de la actividad farmacológica (DDAF). Estos diagramas son descritos como gráficos de tipo histograma, que son útiles para establecer los intervalos de la función FD en donde la expectativa (E) o probabilidad de encontrar compuestos activos es máxima. En los DDAF, E se ubica en el eje de las ordenadas y los valores de la función discriminante, en el eje de las abscisas. Para cada intervalo arbitrario de cualquier función, se define la expectancia de actividad como: Ea = a/(i+1), donde a es el cociente entre el número de compuestos activos en el intervalo dividido por el número total de compuestos activos, e i es el número de compuestos inactivos en el intervalo dividido por el número total de compuestos inactivos. La expectativa de inactividad también se obtiene de la misma manera, como Ei = i/(a+1). Esta representación nos permite ver las zonas en las que la superposición o solapamiento es mínima, así como determinar los intervalos de la función discriminante, donde la probabilidad de encontrar nuevos compuestos activos es máxima en relación con la elección de un falso activo [31].

Análisis de regresión multilineal (MLRA)

La regresión lineal múltiple permite generar un modelo lineal en el que el valor de la variable dependiente o respuesta, pEC₅₀, (pEC₅₀ = –log[EC₅₀]) se predice a partir de un conjunto de variables independientes llamadas predictores (IT). Para hacer el análisis de regresión multilineal (MLRA) se utilizaron los compuestos con valores cuantitativos de EC₅₀ en unidades µM. Además, el compuesto LabMol-127 se eliminó al tratarse de un outlier. El número de compuestos para hacer el análisis quedó reducido a 24.

El juicio para la selección de variables consistió en usar la agrupación con menor número de variables para evitar un sobreajuste, que el valor del coeficiente de correlación múltiple, R², sea alto (R² > 0,8) y que el error estándar de estimación fuera mínimo. Para aceptar la función de predicción se realizó un test de validación interna. La validación de la función de predicción se hace a través de una crosvalidación interna del tipo leave one out; es decir, determinar el coeficiente de predicción (Q²). Cada compuesto es eliminado del modelo y el valor de la actividad, pEC₅₀, se recalcula con los demás compuestos y descriptores de la ecuación seleccionada. El proceso se repite tantas veces como compuestos se estudien. Con los valores predichos se determina el valor del coeficiente de predicción (Q²) y se compara con el valor del R². Los valores de Q² > 0,7 nos muestran que la función obtenida es predictiva y, por tanto, que el modelo seleccionado es de buena calidad.

resultados Y DISCUSIÓN

Análisis lineal discriminante

La función discriminante obtenida mediante ALD fue aplicada a un total de 39 compuestos, utilizándose al benznidazol como fármaco de referencia. Los compuestos fueron clasificados como grupo activo si presentaban una EC₅₀ menor a 10.0 µM. La FD seleccionada fue:

FD = 8,073VEA1 - 4,540DECC - 12,33GATS4 e - 7,734GATS8p - 6,292 N = 39        Wilks’ Lambda, λ = 0,376 F (4, 34) =14,11        p< 0,00001

Ec. 1

Los índices topológicos que intervienen en la Ec. 1 son: VEA1, índice obtenido a partir de los valores propios de la matriz de adyacencia; DECC, índice de excentricidad; GATS4e, índice de autocorrelación 2D de Geary –lag4 (que utiliza la electronegatividad atómica); y GATS8, índice de autocorrelación 2D de Geary –lag8 (que utiliza la polarizabilidad atómica) [24].

Las variables utilizadas en la Ec. 1 son estadísticamente significativas, con una p <0,05.

A partir de la FD, un compuesto será considerado como potencial droga si la FD es mayor a 0. La matriz de clasificación ubicó correctamente en el grupo activo al 93,3 % de los compuestos y en el grupo inactivo al 91,7 % de los compuestos, correspondiendo estos valores a la sensibilidad y especificidad respectivamente. Clasificó a la totalidad de los compuestos con una exactitud del 92,3 %.

La clasificación de cada compuesto, el valor calculado de la función discriminante y la probabilidad de actividad se ilustran en la tabla 2.

La validación de la FD se realizó mediante un test interno de tipo leave some out. Para ello, los compuestos fueron divididos en 4 subgrupos: A, B, C y D, cada uno con aproximadamente el 25 % de los compuestos. A continuación, se realizó el ALD con los mismos índices topológicos de la FD y se usó como grupo de entrenamiento tres de los cuatro subgrupos. El cuarto se utilizó como test de predicción. El proceso se repitió cuatro veces, intercambiando los subgrupos de entrenamiento y de predicción. Los valores promedio de sensibilidad y especificidad del grupo de entrenamiento y grupo test fueron 90,0 y 96,8 %; 94,4 y 83,3 %, respectivamente. Los resultados obtenidos de discriminación fueron, entonces, similares a los observados por la FD seleccionada.

En la figura 1 se muestra el diagrama de actividad obtenida con la FD. Mediante observación del diagrama, el dominio de aplicación de la FD para la búsqueda de potenciales compuestos activos se da para valores de FD comprendidos entre 0 y 7.

Regresión multilineal

Para hacer el análisis de regresión multilineal (MLRA) se utilizaron los compuestos con valores cuantitativos de EC₅₀. Se eliminó el compuesto LabMol-127 por tratarse de un outlier, al igual que los compuestos cuyos valores de concentración estaban indicados en la tabla 2 como >200. De este modo, el tamaño de la muestra quedó reducido a 24 compuestos. La función de predicción seleccionada fue:

pEC50 = -27,93 - 0,30nO + 1,76 J + 2,62MATS8p + 15,658BELv1 N=24        R2=0,909        Q2=0,841        EEE=0,290       F(4,19)=47,2        p<0,00001

Ec. 2

Puesto que el p obtenido es menor a 0,05, podemos afirmar que todas las variables del modelo son estadísticamente significativas. En la función de predicción intervienen cuatro índices topológicos: el número de átomos de oxígeno (nO), un descriptor constitucional; un descriptor topológico, el índice de Balaban (J), un índice de autocorrelación 2D que utiliza la polarizabilidad atómica, el índice de autocorrelación de Moran –lag8; y uno de los valores propios de Burden, el valor propio más bajo obtenido con la matriz de Burden, ponderada por los volúmenes atómicos de Van der Waals [24].

Para la validación de la función de predicción, se realizó también una validación cruzada interna del tipo leave one out. Se obtuvo un valor del coeficiente de predicción, Q2=0,841.

En la figura 2 se muestra la correlación obtenida entre los valores experimentales (pEC₅₀ exp), y los predichos (pEC₅₀ pred), con la función de predicción seleccionada. Se observa un R2 de 0,9086, por lo que el 90,86 % de la variabilidad de pEC₅₀ queda explicada por el modelo.

La presencia de posibles outliers se visualiza en la figura 3. Puesto que el error estándar de estimación (EEE) es igual a 0,290, podemos decir que no se observan valores fuera del rango de ± 2*EEE.

En conclusión, puesto que la bondad de ajuste es correcta (R²>0,9), el coeficiente de predicción obtenido de la crosvalidación interna, Q²>0,8 y además todos los valores se encuentran dentro del rango de ± 2*EEE, se acepta el modelo de regresión lineal múltiple como apto para la predicción de pEC₅₀. Así, este modelo podrá ser usado en la predicción de la actividad antitripanosomal de los nuevos compuestos.

Utilizando los modelos anteriormente descritos, se ha realizado un screening virtual para proponer nuevos compuestos potencialmente activos. Sobre la base de los resultados obtenidos con el ALD y el MRLA, un compuesto se seleccionará como activo frente a Trypanosoma cruzi si la función discriminante toma valores comprendidos entre 0 y 6 y la función de predicción, valores de pEC₅₀>6,0 (EC₅₀<1µM).

A partir de los tres compuestos más activos LabMol-97, LabMol-125 y LabMol-134, se han seleccionado 150 análogos de la base de datos molecular PubChem [32]. Después de obtener sus índices topológicos se seleccionaron los ocho compuestos encontrados en la tabla 3, ya que son activos en cuanto a la función discriminante y presentan un valor de predicción pEC₅₀>7,00, lo que se corresponde a una actividad EC₅₀ < 0,1μM.

En la última década se han realizado numerosos ensayos clínicos con nuevas drogas candidatas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Aunque el benznidazol sea uno de los fármacos de referencia, su rol en aquellos pacientes que padecen patologías propias de la fase crónica es controversial [33]; sin mencionar que además presenta un alto grado de toxicidad. El posaconazol y otros derivados azólicos han sido utilizados en numerosos ensayos, con tasas elevadas de fallo al tratamiento [34].

El desarrollo de nuevas drogas antitripanosomales constituye un desafío. Mediante un modelo QSAR, hemos predicho la actividad antitripanosomal de ocho moléculas usando al benznidazol como referencia. Se ha realizado una búsqueda bibliográfica de dichos compuestos a través de PubChem [32]. Ninguno ha sido estudiado previamente como antiparasitario. CID-1512007 ha sido clasificada como inactiva frente a Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus y Vibrio cholerae, entre otros microorganismos. CID-151534349 está categorizado como agonista de prostaglandinas, sin evaluación previa respecto a la actividad antimicrobiana. CID-2939950 ha sido estudiada como potencial droga frente a Mycobacterium tuberculosis, y ha demostrado ser inactiva. Hemos de mencionar que varias moléculas se encuentran patentadas [32].

CONCLUSIONES

Se ha conseguido realizar un cribado eficaz de moléculas potencialmente activas al aplicar la topología molecular en la búsqueda de ecuaciones de predicción para compuestos citotóxicos antitripanosomales. Los modelos QSAR basados en descriptores topológicos grafo-teóricos permiten optimizar en tiempo y coste la búsqueda de nuevos compuestos y su posterior caracterización experimental. Se describen ocho moléculas potencialmente activas que han de ser estudiadas a posteriori a fin de corroborar o refutar su papel como fármacos contra la enfermedad de Chagas.

AGRADECIMIENTOS

C. T. C. R., A. C. O. P., A. M. M. y C. B. L. agradecen al máster en Enfermedades Parasitarias Tropicales de la Universitat de València el haber permitido realizar este trabajo. J. G y R. G. D agradecen al proyecto: PID2019-107464RB-C22, “Diseño racional de nuevas herramientas de fitoprotección (Newcropproctools)” concedido por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España por el material utilizado para la realización de este trabajo.

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