Nereis. Interdisciplinary Ibero-American Journal of Methods, Modelling and Simulation.

INTRODUCCIÓN

La lesión por isquemia/reperfusión (Ischemia/Reperfusion, en adelante I/R) ocurre cuando a un tejido animal se le priva de flujo sanguíneo –y por tanto de oxígeno– durante un periodo prolongado de tiempo y, a continuación, se restablece el flujo, lo que produce una gran cantidad de radicales libres de oxígeno (Radical Oxigen Species, en adelante ROS) en las células de dicho tejido [1].

La I/R es una de las principales complicaciones que pueden existir en una operación quirúrgica de trasplante de órgano [2]. Con anterioridad a la operación, el órgano extraído del donante sufre un proceso de hipoxia fría durante su conservación a 4 ºC hasta el momento de la operación [2]. Posteriormente, tanto el tejido vascular del paciente durante el proceso de clamping arterial como el del órgano que se va a trasplantar son propensos a sufrir I/R en el momento de la intervención quirúrgica [4]. Finalmente, el paciente puede sufrir retardo en la función del injerto (Delayed Graft Function, DGF), consecuencia de haber sufrido daño celular durante el trasplante, y el órgano puede perder su función e incluso ser rechazado [5].

Con el fin de evitar la formación de ROS, o al menos paliar sus efectos a nivel celular, diversos estudios [2,6,7] sugieren que los antioxidantes son capaces de inhibir en gran medida el daño oxidativo causado por la I/R. Los antioxidantes son sustancias capaces de aceptar los electrones desapareados de los ROS, evitando así que estos oxiden otras moléculas en el tejido [8].

Existen dos clases de compuestos antioxidantes atendiendo a su origen. Los antioxidantes endógenos o enzimáticos son sintetizados por el mecanismo de transcripción/traducción celular, como es el caso de los enzimas catalasa, peróxido dismutasa, glutatión peroxidasa, reductasas, etcétera [9]. La otra clase de antioxidantes son los llamados exógenos o no enzimáticos, que no tienen un origen peptídico [10].

Los antioxidantes exógenos o no enzimáticos pueden ser naturales o sintéticos, siendo los de origen natural, por lo general, menos dañinos para los organismos [11], y habiéndose reportado en algún caso una mayor capacidad antioxidante en comparación con los sintéticos [12,13]. Además, los antioxidantes sintéticos en ocasiones son capaces de causar alergias o carcinomas debido a su toxicidad [14].

Dentro de los antioxidantes exógenos naturales se pueden distinguir varias familias de sustancias: vitaminas, pigmentos, polifenoles y polisacáridos sulfatados [15]. Estas moléculas son producidas por los organismos vivos fotosintéticos como una primera defensa ante agresiones oxidativas externas [16].

Utilizando el extractante adecuado, estas sustancias pueden ser extraídas de diversos organismos fotosintéticos, tanto de plantas vasculares [12,17-21] como de algas [6,22-24], y se ha demostrado que el extracto resultante puede tener una actividad antioxidante que puede ser utilizada para paliar el daño por I/R.

En este sentido, en estudios de experimentación animal con ratas, se ha comprobado que los extractos metanólicos de galio (Galium verum) pueden evitar lesiones cardiovasculares derivadas de la I/R (18) y los de granado (Punica granatum) son capaces de proteger el tejido nervioso del cerebro de la formación de ROS [20]. Los extractos butanólicos de corteza de manglar también han mostrado potencial para el tratamiento de lesiones estomacales causadas por I/R [19].

Existen algunos trabajos en los que se pone de manifiesto la capacidad de los extractos o compuestos extraídos de algas para paliar la lesión por I/R. Por una parte, los fucoidanos del alga parda Fucus vesiculosus han mostrado su eficacia frente a la apoptosis y la autofagia de las células hepáticas de ratones cuando se ven sometidas a la lesión por I/R [22]. Del mismo modo, los extractos organoacuosos de Himanthalia elongata han mostrado un gran potencial en el tratamiento de la lesión intestinal por I/R en ratas [6]. Por otra parte, se ha visto que el bromofenol extraído de algas rojas posee una notable capacidad antioxidante frente a los radicales libres generados en la lesión por I/R en cardiomiocitos de embriones de rata [25]. Los polisacáridos presentes en Porphyra yezoensis, los porfiranos, también pueden paliar el daño por estrés oxidativo en el tejido nervioso de ratas [26]. Se demostró que un extracto de Palmaria palmata diluido al 1 % en gel no presenta citotoxicidad ni fototoxicidad en una monocapa de fibroblastos [27]. Aun así, se desconoce en gran medida el potencial antioxidante que pueden llegar a tener los extractos brutos de algas rojas y su posterior aplicación como fármaco.

Asimismo, es imprescindible realizar además una serie de test toxicológicos, ya que, a pesar de que muchos extractos vegetales o algales con capacidad antioxidante tienen capacidad para prevenir o paliar los efectos de la lesión por I/R, es necesario someter al extracto a una serie de ensayos previos para comprobar que no es tóxico para el organismo que se está tratando [28,29].

En este sentido, la línea celular HaCaT (queratinocitos humanos inmortalizados) se ha utilizado ampliamente en ensayos de crecimiento y diferenciación celular [30], aunque se utilizan también para detectar actividad citotóxica y antitumoral en diversos compuestos y extractos. Concretamente, se ha utilizado tanto en ensayos de extractos de plantas [15,31,32] como de algas [33,34].

Se comprobó que las líneas celulares inmortalizadas procedentes de tumores pueden utilizarse para detectar citotoxicidad en extractos de cianobacterias [35]. También se ensayaron extractos de algas rojas utilizando líneas celulares inmortalizadas, y se averiguó que los procedentes de Asparagopsis armata, Brongniartella byssoides y Heterosiphonia plumosa mostraban actividad citotóxica [36].

Por otro lado, se llevaron a cabo ensayos toxicológicos con nauplios de Artemia salina en un trabajo en el que se midió la toxicidad de los extractos de 29 plantas vasculares colombianas, de las que se extrajeron por separado varias familias de compuestos de interés toxicológico (alcaloides, flavonoides, taninos, nafta y/o antraquinonas, saponinas, esteroides y/o triterpenoides, lactonas terpénicas, cumarinas y cardiotónicos) y se evaluó el carácter tóxico de cada fracción por separado [37].

También se utilizaron nauplios, en este caso de 48 horas de vida, para medir la toxicidad de extractos etanólicos resuspendidos en DMSO de varias especies del género Solanum procedentes de Brasil [38].

Recientemente, también se han utilizado nauplios recién eclosionados para medir la toxicidad de extractos metanólicos de Bacopa monnieri [39] y de extractos acuosos de Moringa oleifera, una planta medicinal hindú [40].

En otro trabajo, se analizó la toxicidad de 38 extractos metanólicos y acuosos de macroalgas pardas, rojas y verdes de la costa coreana con el fin de detectar actividad tóxica para invertebrados [41].

Por todo lo expuesto anteriormente queda patente el interés en emplear ensayos de toxicidad aguda con queratinocitos de la línea celular HaCaT y con nauplios de Artemia salina en la detección de la posible actividad citotóxica de los extractos de algas.

Finalmente, el objetivo de este estudio es determinar la toxicidad de los extractos de Palmaria palmata y Porphyra sp. de manera previa a su empleo en el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión utilizando como indicadores de toxicidad de los extractos la concentración letal al 50 % (Lethal Concentration at 50 %, LC₅₀) y el nivel sin efecto adverso observable (No Observed Adverse Effect Level, NOAEL) de dichos extractos en la línea celular HaCaT (queratinocitos humanos inmortalizados) y en nauplios en estadio instar II de Artemia salina. Por otro lado, se pretende proponer un índice que tenga en cuenta tanto la actividad antioxidante como la actividad tóxica de los extractos obtenidos, calculada a partir de la NOAEL y de la LC₅₀ obtenidas en los ensayos anteriores, y con el que se pueda comparar la eficiencia potencial de cada alga en cada ensayo realizado.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de extractos y actividad antioxidante

Los extractos de Palmaria palmata y Porphyra sp. se obtuvieron con un extractante organoacuoso aplicando en cada caso las condiciones óptimas para obtener la mayor actividad antioxidante (datos pendientes de publicación – tesis doctoral de Samanta García Oms, en proceso de realización).

La actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las algas P. palmata y Porphyra sp. fue analizada mediante el test de DPPH [42] mostrando una actividad de 78,7 y 87,63 % respectivamente.

A continuación, 5 mL de cada extracto fueron rotavaporados durante 20 minutos a 50 ºC bajo presión negativa para retirar el extractante. El extracto seco fue resuspendido en 5 mL de DMEM para el ensayo MTT-24h, o en 5 mL de solución salina para el ensayo Artemia-24h.

Línea celular

Los queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) se obtuvieron del Instituto de Investigación Príncipe Felipe (Valencia) y fueron cultivados en monocapa en flasks de cultivo celular con DMEM (High glucose, BioWest) en una incubadora de dióxido de carbono (Memmert, Tecnigen). El medio se cambió dos veces por semana.

Nauplios de Artemia salina

Los nauplios de Artemia salina fueron obtenidos a partir de quistes comerciales (ARTEMIA-mix, SERA) y eclosionados en un medio salino [43,44] que contenía: NaCl, 23 g/L; MgCl2 · 6 H2O, 11 g/L; CaCl2 · 6 H2O, 2 g/L; y KCl, 0,7 g/L, con el pH ajustado a 8,5 con NaOH, e incubados a una temperatura de 26 ºC.

Ensayos de toxicidad MTT-24h con células humanas (HaCaT)

La toxicidad de los extractos de Palmaria palmata y Porphyra sp. se monitorizó utilizando el ensayo MTT en queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) siguiendo el protocolo de Li et al. [31]. Las células, cultivadas en monocapa en un flask, fueron puestas en suspensión tras un tratamiento con tripsina comercial (10x, 1 mL, 10 min, 37 ºC) y diluidas en 4 mL de DMEM (High glucose, BioWest). Se homogeneizaron suavemente, se tomó una alícuota de 20 µL a la que se añadieron 20 µL de azul tripán, y se hizo un recuento con cámara Neubauer. Se tomó el volumen requerido de la suspensión madre de células para obtener una población de 10.000 células por pocillo de experimentación, se diluyeron dichas células en DMEM hasta obtener un volumen de 6 mL (100 µL por pocillo de experimentación), se homogeneizó suavemente la dilución obtenida y se dispusieron 100 µL por pocillo en los 60 pocillos centrales de placas de 96 pocillos para eliminar el efecto borde.

Transcurridas 24 h, se comprobó la adherencia de las células al fondo de los pocillos con un microscopio invertido de contraste de fases y se retiró el medio con una pipeta Pasteur de vidrio con cuidado de no dañar la monocapa. Se dispensaron 100 µL con una concentración de 100, 50, 25, 10, 5 y 1 % (v/v) del extracto diluido en DMEM en cada pocillo.

Tras un periodo de 24 h, se retiró el medio con una pipeta Pasteur de vidrio y se dispensaron 100 µL de una dilución de MTT (1:11 en DMEM). Tras incubar durante 3 h, se retiró el MTT y se añadieron 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO, CH₃SOCH₃, ≥99,9 %, Fischer Chemical) a cada pocillo para disolver los cristales formados. Se midió la absorbancia de los pocillos a 600 nm con un lector de placas (Varioskan Lux, Thermo Scientific).

Los resultados de viabilidad celular a partir de la actividad mitocondrial se expresaron en porcentaje (%) de absorbancia respecto al control, como indica la siguiente ecuación:

donde A_TREATMENT es la absorbancia de cada pocillo experimental y A_CONTROL es la absorbancia media del control. Todos los procedimientos fueron llevados a cabo en una cabina de flujo laminar y bajo condiciones de esterilidad.

Ensayos de toxicidad Artemia-24h con nauplios de Artemia salina

La toxicidad de los extractos de Palmaria palmata y Porphyra sp. se monitorizó utilizando el ensayo de toxicidad con Artemia salina [44]. Los nauplios fueron mantenidos en una solución salina modificada [43] que contenía: NaCl, 23 g/L; MgCl₂ · 6 H₂O, 11 g/L; CaCl₂ · 6 H₂O, 2 g/L; y KCl, 0,7 g/L, con el pH ajustado a 8,5 utilizando NaOH 10 %, y a una temperatura de 26 ºC.

Combinando los métodos de Sarabia [45] y de González y Gilling [46], se dispusieron 10 ± 2 nauplios en estadio instar II en placas de 48 pocillos que contenían 400 µL del 100, 50, 25, 10, 5 y 1 % (v/v) del extracto diluido en solución salina en cada pocillo.

Tras 24 horas, se hizo un recuento de los nauplios que presentaban motilidad en cada pocillo. Los animales que no presentaban movimiento de los apéndices o del tracto digestivo se contabilizaron como muertos. En caso de que el número de nauplios en un pocillo fuese diferente a 10, se calculó proporcionalmente el porcentaje de mortalidad.

Los resultados de supervivencia de los nauplios se expresaron en porcentaje (%) de supervivencia respecto al control, como indica la siguiente ecuación:

donde S_TREATMENT es la supervivencia de cada pocillo experimental y S_CONTROL es la supervivencia media del control (>95 %).

Como control positivo de toxicidad en los ensayos con A. salina, se realizó paralelamente un ensayo con dicromato potásico (K₂Cr₂O₇, >99,9 %, Merck) disuelto en solución salina a las concentraciones de 20, 15, 10 y 5 µg/mL, según el método de González y Gilling (2001).

Propuesta de Índice de Eficiencia Antioxidante (IEA)

Con el fin de comparar el potencial farmacológico de los extractos de ambas algas, teniendo en cuenta tanto la capacidad antioxidante como la toxicidad que muestra cada uno, se propuso un Índice de Eficiencia Antioxidante que multiplica el porcentaje de capacidad antioxidante de cada extracto por cada uno de los dos parámetros toxicológicos, NOAEL y LC₅₀, obtenidos previamente en cada tipo de ensayo.

El cálculo de los índices se realiza de la siguiente manera:

IEA_NOAEL = AA × NOAEL

IEA_LC50 = AA × LC₅₀

donde IEA_NOAEL e IEA_LC50 son, respectivamente, los índices de eficiencia antioxidante de la NOAEL y de la LC₅₀ de cada extracto para cada ensayo y AA es la actividad antioxidante de cada extracto expresada en porcentaje. El resultado de ambas operaciones está expresado en porcentaje de actividad antioxidante por concentración (%, v/v) del extracto inicial.

Se compararon, dos a dos, el IEA de cada parámetro toxicológico, NOAEL y LC₅₀, y cada ensayo. Puesto que unos valores altos de tanto la actividad antioxidante como los parámetros toxicológicos calculados aumentan el potencial farmacológico de los extractos, el extracto con el IEA más alto se consideró el más apto para continuar con los ensayos preclínicos.

Todos los ensayos se llevaron a cabo siguiendo el Reglamento (CE) n.º 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (UE, 2006), y el Reglamento (CE) n.º 440/2008 de la Comisión de 30 de mayo de 2008 por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento anterior (UE, 2008).

Análisis estadístico

Los datos recogidos fueron estadísticamente analizados utilizando un test de varianza de una vía (ANOVA) de SPSS (versión 17.0) con un p-valor = 0,05 para hallar el nivel sin efecto adverso observable (NOAEL) para cada ensayo y extracto, y se representaron los valores medios ± desviación estándar (n = 12 en MTT-24h y n = 6 en Artemia-24h).

Asimismo, se realizó, partiendo de los datos anteriores, un análisis de regresión probit para averiguar la LC₅₀ de cada ensayo y extracto.

RESULTADOS

Ensayo de toxicidad MTT-24h

Los resultados del ensayo de toxicidad de los extractos de Palmaria palmata y Porphyra sp. en queratinocitos humanos inmortalizados se muestran en la figura 1. Como puede apreciarse, el NOAEL del extracto de P. palmata en queratinocitos humanos inmortalizados es menor que un 1 % (v/v) del extracto inicial, mientras que en el caso de Porphyra sp. es de un 1 %. Se puede descartar que el excipiente sea el factor causante de la toxicidad observada, ya que los grupos Control y Excipiente no presentan diferencias significativas (p < 0,05).

Los resultados del análisis probit del ensayo MTT-24h para Palmaria palmata y Porphyra sp. se muestran en la figura 2, y mostraron unas LC₅₀ de 7,8743 % y 10,7463 % (v/v) del extracto, respectivamente.

Estos resultados confirman lo observado en el análisis de los NOAEL, ya que la LC₅₀ del extracto de P. palmata es inferior a la LC₅₀ de Porphyra sp., lo que sugiere que el extracto de P. palmata presenta mayor toxicidad frente a queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT).

Los resultados del ensayo de toxicidad de los extractos de Palmaria palmata y Porphyra sp. en nauplios de Artemia salina se muestran en la figura 3. Como puede apreciarse, el NOAEL del extracto de P. palmata para nauplios de A. salina en estadio instar II es menor que una concentración del 1 % (v/v) de extracto, mientras que para Porphyra sp. es del 5 %. Se puede descartar que el excipiente sea el factor causante de la toxicidad observada, ya que los grupos Control y Excipiente no presentan diferencias significativas (p < 0,05).

Los resultados del análisis probit del ensayo Artemia-24h para Palmaria palmata y Porphyra sp. se muestran en la figura 4, y mostraron unas LC₅₀ de 3,2583 y 6,5688 % del extracto, respectivamente.

Estos resultados confirman lo observado en el análisis de los NOAEL, ya que la LC₅₀ del extracto de P. palmata es inferior a la LC₅₀ de Porphyra sp., lo que sugiere que el extracto de P. palmata presenta mayor toxicidad frente a nauplios de A. salina en estadio instar II, aunque sería necesario realizar un screening más fino entre los valores de 10 y 1 % (v/v) de concentración de extracto que asegurase una distribución más ajustada a una función probit de los datos de mortalidad, sobre todo en el caso de Porphyra sp. (R² = 0,7059). Los resultados del control positivo con dicromato potásico mostraron una LC₅₀ de 7,7304 µg/mL.

Los resultados de NOAEL, LC₅₀ e IEA calculados para cada alga en cada ensayo se muestran en la tabla 1.

Como se ha descrito anteriormente, los niveles sin efecto adverso observable (NOAEL) obtenidos para el extracto de Palmaria palmata dan como resultado <1 % (MTT-24h) y 1 % (Artemia-24h) de concentración (v/v) de extracto, mientras que en el caso del extracto de Porphyra sp. dan como resultado 1 % (MTT-24h) y 5 % (Artemia-24h) de concentración (v/v) de extracto que, comparando por separado los resultados de cada ensayo, permiten afirmar que hay indicios de que el extracto de P. palmata presenta más toxicidad que el extracto de Porphyra sp.

Por otra parte, las LC₅₀ obtenidas para el extracto de P. palmata dan como resultado 7,8743 % (MTT-24h) y 3,2583 % (Artemia-24h) de concentración (v/v) de extracto, mientras que en el caso del extracto de Porphyra sp. dan como resultado 10,7463 % (MTT-24h) y 6,5688 % (Artemia-24h) de concentración (v/v) de extracto que, comparando por separado los resultados de cada ensayo, corroboran los resultados obtenidos en el cálculo de los NOAEL.

Finalmente, en el cálculo de los IEA_NOAEL tanto para el ensayo MTT-24h como para el de Artemia-24h para cada ensayo se pueden observar valores más altos en el caso del extracto de Porphyra sp. que el de Palmaria palmata.

Como en el caso anterior, la comparación de los IEA_LC50 tanto para el ensayo MTT-24h como para el de Artemia-24h para cada ensayo se obtuvo un valor más alto para el extracto de Porphyra sp. que para el de P. palmata, lo que permitiría confirmar que Porphyra sp. es el alga más adecuada para continuar con los ensayos en lo que respecta a la actividad antioxidante y toxicidad del extracto.

DISCUSIÓN

A pesar de la percepción generalizada de que los productos vegetales naturales no producen efectos secundarios [47], lo cierto es que muchos productos cosméticos o farmacológicos pueden producir síntomas de carácter leve, como irritación o inflamación del tejido que ha entrado en contacto con el compuesto [27], o problemas de carácter más severo, como retrasos en el desarrollo embrionario [48], carcinogénesis [49], teratogénesis [50], etcétera.

Estos efectos de carácter tóxico pueden tener lugar debido a metabolitos del propio vegetal [35,37,43] o a especies químicas de origen antrópico que el organismo fotosintético absorbe durante su vida [48,51,52].

En primer lugar, al tratarse de extractos brutos en los que no ha habido fraccionamiento, purificación o aislamiento de las diferentes fases, como en otros trabajos con diversas matrices [19,33,35,53,54], los NOAEL y las LC₅₀ obtenidos para cada extracto podrían verse afectados por la mortalidad causada por el pH o la concentración salina de dicho extracto. Estos efectos podrían cuantificarse realizando ensayos toxicológicos con las diferentes fracciones del extracto para detectar aquellas que muestren actividad tóxica [55].

El pH puede ser la causa de que las LC₅₀ obtenidas en Artemia-24h sean menores que las observadas en MTT-24h, ya que en este último tipo de ensayo el medio donde se encuentran las células durante el periodo de exposición el medio se encuentra tamponado gracias a una inyección constante de CO₂ en la incubadora, a diferencia del ensayo con nauplios de Artemia salina, donde la capacidad de tamponamiento de la solución salina es menor. No obstante, para averiguar si realmente las LC₅₀ de cada extracto Artemia-24h son menores que en el ensayo MTT-24h, sería necesario realizar un screening más afinado entre las concentraciones 1 y 15 % (v/v) del extracto inicial. Además, de esta manera se podrían recalcular los NOAEL y las LC₅₀ de una manera más precisa.

Pese a ello, la LC₅₀ calculada en el ensayo Artemia-24 con dicromato potásico para nauplios en estado instar II fue de 7,7304 µg/mL, similar a la obtenida por otros autores: 7,4 µg/mL [56] y 12,5 µg/mL [46], lo que confirma la correcta sensibilidad de los nauplios utilizados en los ensayos con los extractos y la adecuada preparación de la solución salina utilizada como medio en el ensayo.

Por otro lado, las sales presentes en la matriz pueden ser arrastradas al extracto, haciendo que la concentración de iones de este aumente. Schiener et al. (52) observaron que Palmaria palmata, tras sufrir procesos de biorrefinación con extractantes organoacuosos, puede presentar hasta un 35 % de los cloruros del alga sin refinar. También se vio, en el mismo estudio, que se conservan en porcentajes no menores a un 40 % las sales de arsénico y de yodo, y metales como el zinc, el cobre y el hierro respecto a las cantidades observadas en el alga en bruto, lo que podría aumentar, de manera exógena, la toxicidad de los extractos de P. palmata.

Maruthanayagam et al. [35] observaron que un extracto acuoso de Geitlerinema sp., una cianobacteria, presentaba toxicidad en Artemia salina y en líneas celulares cancerosas. Sin embargo, al fraccionar dicho extracto se descubrió que la toxicidad del extracto solamente se debía a 7 compuestos orgánicos.

Lee, Nishizawa, Shimizu, y Saeki [57] extrajeron la fracción hidrosoluble de P. palmata y a continuación aislaron las ficobilinas del alga. Dichas ficobilinas, que por otro lado presentaban actividad antiinflamatoria, no presentaron toxicidad en macrófagos de ratón (RAW264.7) en el rango de 100 a 1000 µg/mL.

En este sentido, se puede sospechar que, en parte, la actividad tóxica de los extractos brutos de algas se deba a compuestos e iones que proceden del ambiente en el que vive el alga, y que podrían ser retirados o aislados del extracto con un fraccionamiento adecuado, como en el método utilizado por Harnedy et al. (54) para el aislamiento de péptidos con actividad antioxidante en P. palmata, o la purificación de polisacáridos presentes en Solieria chordalis y P. palmata realizada por Suwal et al. [58].

No obstante, tanto las especies químicas exógenas como el pH o la concentración salina de los extractos de vegetales con capacidad antioxidante son factores que hay que tener en cuenta toxicológicamente si se pretende utilizar el extracto bruto en los ensayos preclínicos, ya que se trata de mezclas complejas de las que no existe suficiente información y no se controlan todos los parámetros fisicoquímicos [14] que pueden favorecer la aparición de los síntomas anteriormente mencionados, que son especialmente peligrosos en el caso de trasplante de órganos [2,59-61].

Dentro de las mezclas complejas que son los extractos brutos vegetales, se ha visto que un screening de los principales grupos químicos potencialmente tóxicos no basta para establecer relaciones entre concentración de estos compuestos y la actividad tóxica que muestra el extracto, pudiendo deberse dicha actividad a especies químicas no detectadas [37], e incluso pudiendo variar entre especies la sensibilidad frente al extracto dependiendo de los compuestos detectados [41]. En el presente estudio, la sensibilidad de los nauplios en estado instar II utilizados en el ensayo Artemia-24h y de las single cells del ensayo MTT-24h frente a los extractos podría diferir, por lo que solo son válidas las comparaciones entre grupos del mismo tipo de ensayo.

También se ha reportado, en otras ocasiones, que la toxicidad de un producto utilizado en cosmética, alimentación o farmacología se deba a residuos del proceso de extracción (62) o al excipiente que acompaña a dicho producto al ser administrado [63-65]. No es el caso de los extractos analizados en el presente estudio, ya que en ninguno de los ensayos el grupo Excipiente, que contenía el posible residuo del extractante puro tras ser rotavaporado y resuspendido, difería significativamente del grupo Control. Por otra parte, no se puede descartar que existan efectos sinérgicos entre el extractante y otros compuestos del alga que aumenten la toxicidad de los segundos, aunque es un factor inherente al método de extracción que igualmente debe ser detectado con los ensayos llevados a cabo.

En lo que respecta a la toxicidad de extractos de las diferentes algas, Álvarez-Gómez, Korbee, Casas-Arrojo, Abdala-Díaz y Figueroa [66] llevaron a cabo un screening toxicológico de extractos organoacuosos en bruto de Hydropuntia cornea y Gracilariopsis longissima, dos algas rojas. Para ello utilizaron como líneas celulares macrófagos de ratón (RAW264.7), fibroblastos gingivales (HGF) y queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT), dando como resultado una LC₅₀ de 259,5 mg/mL del extracto liofilizado y resuspendido de H. cornea en el caso del ensayo MTT-24h con HaCaT, no obteniéndose datos para este ensayo con el extracto de G. longissima. Con HGF, las LC₅₀ de los extractos de H. cornea y G. longissima dieron como resultado 250,7 y 4,2 mg/mL respectivamente, mientras que en RAW264.7 las LC₅₀ observadas fueron 0,12 y 0,41 mg/mL respectivamente, poniendo de manifiesto la posibilidad de que dos especies de algas rojas puedan mostrar una toxicidad diferente en los diversos tipos celulares con los que puede entrar en contacto, lo que no sucede, en principio, en el estudio realizado con Palmaria palmata y Porphyra sp. De hecho, a pesar de que en el presente estudio los NOAEL y las LC₅₀ están referidos a una concentración (%, v/v) de extracto en porcentaje, tanto en el ensayo MTT-24h como en el ensayo Artemia-24h, estos parámetros indican que el extracto de P. palmata es el más tóxico de los dos, manteniéndose las diferencias entre ambos extractos en todo el estudio.

CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente estudio, podemos concluir que tanto el extracto de Palmaria palmata como el de Porphyra sp. presentan toxicidad en queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) y en nauplios de Artemia salina.

El extracto de P. palmata es el más tóxico, presentando un NOAEL de <1 % y una LC₅₀ de 7,8743 % del extracto inicial en el ensayo MTT-24h con queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT), y un NOAEL de <1 % y una LC₅₀ de 3,2583 % del extracto inicial en el ensayo Artemia-24h.

Por otro lado, el extracto de Porphyra sp. es el menos tóxico, presentando un NOAEL de 1 % y una LC₅₀ de 10,7463 % del extracto inicial en el ensayo MTT-24h con queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT), y un NOAEL de 5 % y una LC₅₀ de 6,5688 % del extracto inicial en el ensayo Artemia-24h.

Los Índices de Eficiencia Antioxidante (IEA) para cada ensayo y cada parámetro toxicológico mostraron que el extracto de Porphyra sp. muestra una mayor actividad antioxidante a la vez que presenta una menor toxicidad que en el caso del extracto de Palmaria palmata. Por tanto, sería deseable escoger el extracto de Porphyra sp. como candidato para continuar los ensayos preclínicos en el desarrollo de un fármaco eficaz para el tratamiento de la lesión por isquemia/reperfusión.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) y al Instituto de Medio Ambiente y Ciencia Marina (IMEDMAR).

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