Nereis. Interdisciplinary Ibero-American Journal of Methods, Modelling and Simulation.

INTRODUCCIÓN

Las levaduras son hongos unicelulares que en biotecnología tienen gran relevancia en los sectores alimentario, farmacéutico, químico, agrícola y medioambiental, entre otros. Son el grupo de microorganismos eucariotas más importante utilizado en el proceso de fermentación de comidas y bebidas. Cabe destacar algunas de las características de las cepas de especial interés, como su capacidad de supervivencia en ausencia de oxígeno, su desarrollo gracias a la presencia de azúcares y su gran facilidad para la propagación en el laboratorio. Además, poseen un genoma de pequeño tamaño, lo que las hace atractivas para estudios genómicos evolutivos y funcionales [1-3].

El fenotipo del sabor es una propiedad extremadamente importante cuando se seleccionan levaduras. Los componentes que influyen en el sabor están afectados principalmente por características poligenéticas que tienen efecto sobre la tolerancia al alcohol, la temperatura o la tasa de fermentación. Las levaduras cerveceras se clasifican en dos especies: Saccharomyces pastorianus y Saccharomyces cerevisiae [4,5].

Las cepas industriales hoy en día son el resultado de siglos de domesticación humana y son genética y fenotípicamente distintas de las cepas salvajes. La domesticación consiste en la selección humana de especies silvestres para obtener variantes que prosperen en ambientes artificiales. Esta domesticación ha llevado a una pérdida de habilidades de supervivencia fuera de un ambiente artificial de medios ricos, y a la aparición de rasgos deseables como la utilización de la maltotriosa, la cual es importante para el desarrollo de las levaduras [6].

MÉTODOS

Obtención y desarrollo de levaduras puras

Las cepas de levaduras utilizadas en el presente trabajo fueron NFAY 29, NFAY 30, NFAY 31 y NFAY 32, donadas por granjas noruegas. Por otra parte, se emplearon cuatro controles. Uno de ellos fue cedido por la colección nacional de levaduras de Reino Unido (NCYC 456, Saccharomyces Pastorianus), otros dos por WhiteLabs (WLP013 y WLP500, ambas Saccharomyces cerevisiae) y el último por una granja noruega (G561 S. cerevisiae).

Se sembraron las cepas de levadura en placas Petri en medio Wort de la compañía Fluka Analytical, posteriormente se aislaron colonias, mediante la técnica de siembra de triple estria, y se obtuvieron cepas puras. Esta técnica se practicó cuatro veces, dejando periodos de cuatro días entre siembras para permitir el crecimiento.

Una vez obtenidas las cepas puras, se inocularon en medio Malt Extract (ME) al 5 %, de la casa comercial VWR, el cual es muy favorable para el desarrollo de las levaduras.

También se realizaron pruebas adicionales con distintos medios, como Wallerstein Laboratories Nutrient Agar (WLN) y Wallerstein Laboratories Differential Agar (WLD), de la compañía Sigma Aldrich.

El primero de ellos nos permitió observar el crecimiento de organismos como levaduras y bacterias, mientras que el segundo fue indicativo de presencia de bacterias. En cuanto a su composición, se trataban de dos medios con la misma composición, a excepción de la cicloheximida, componente que inhibe la síntesis proteica en organismos eucariotas, que solamente se encontraba en WLD. La incubación aeróbica de estos medios se realizó a 27 ºC.

Producción de cerveza y fermentación

Se añadieron las distintas levaduras al mosto obtenido (tal y como se describe en la receta, anexo A), y se realizó la fermentación a dos temperaturas, 22 y 35 ºC, para estudiar las diferencias. El proceso de fermentación se llevó a cabo durante catorce días.

Análisis genéticos

La región interna espaciadora transcrita (ITS) ha sido seleccionada como diana de referencia para la identificación de la especie en hongos. La subunidad grande (LSU) 28S de las levaduras permite averiguar el género al que estas pertenecen. LSU contiene dos regiones hipervariables, LSU1 (pares de bases de la 127 a la 264) y LSU 2 (pares de bases de la 423 a la 636), que fueron analizadas [7-10].

Por otro lado, las levaduras de cerveza, especialmente las domesticadas, muestran una alta capacidad de metabolizar maltotriosa, una fuente de carbono específica encontrada en la cerveza. Los transportadores conocidos de α-glucσsido en S. cerevisiae permiten una utilización eficiente de la maltosa y maltotriosa. MALL 11 es uno de estos transportadores, el cual posee un alelo específico, AGT1, cuya presencia se correlaciona con una eficiente utilización de la maltotriosa por parte de las levaduras. Por todo esto, también se decidió realizar un análisis del transportador de alfa glucósido (AGT1) [11].

Las regiones de interés se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para cada amplificación se hizo uso de unos cebadores específicos, los cuales se detallan en la siguiente tabla.

Los parámetros de la PCR variaron según la región que se analizaba. Para las regiones LSU1 y LSU2 se realizó un ciclo de desnaturalización de 10 min a 94 ºC, seguido de 35 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC durante 45 s; hibridación a 52 ºC 45 s; elongación a 72 ºC 1 min, y por último un ciclo de elongación final de 72 ºC durante 10 min.

Para la región ITS se realizó un ciclo de desanturalización a 95 ºC 10 min, 35 ciclos de: desanturalización 94 ºC 20 s; hibridación a 47 ºC 30 s; elongación a 72 ºC 40 s, y por último un ciclo de elongación final de 72 ºC durante 7 min.

Para AGT1 un ciclo de desanturalización a 94 ºC 3 min, 35 ciclos de: desnaturalización 94 ºC 1 min, hibridación 58 ºC 2 min, elongación 72 ºC 2 min, y por último un ciclo de elongación final de 72 ºC durante 10 min.

La presencia de ADN en las muestras tras la PCR se comprobó mediante electroforesis. Los geles se visualizaron utilizando el transiluminador UV-Visible G: BOX de Syngene y el software GeneSnap.

A continuación se purificaron los amplicones con el kit QIAquick PCR Purification de la casa comercial Qiagen, siguiendo las indicaciones del fabricante. Las muestras fueron secuenciadas por la empresa GATC Biotech.

Una vez obtenidos los resultados de la secuenciación se procesaron con el programa CloneManager para obtener la secuencia nucleotídica definitiva, que fue analizada con las herramientas del Proyecto de base de datos ribosomal (RDP). En concreto, 16SrRNA training set 16 para LSU1 y LSU 2 y Warcup Fungal ITS trainset 2 para ITS.

En cuanto a AGT1, se analizó con el programa Seaview para analizar si el gen estaba presente o defectivo.

Análisis químicos

Cromatografía de gases acoplada a espectrofotomería de masas con inyección
en espacio de cabeza (HS/GC-MS)

La cromatografía de gases con inyección en espacio de cabeza, o HeadSpace (HS/GCMS), es una técnica ideal para el análisis cualitativo o cuantitativo de especies volátiles. En cerveza resulta muy útil, ya que revela la identidad y concentración de aquellos componentes volátiles que son responsables del sabor [12,13].

El método del estándar interno (ISTD) proporciona una cuantificación muy precisa y por lo tanto es el método más comúnmente utilizado. El estándar interno corrige las pérdidas durante las etapas de separación y concentración, además de la variación en la cantidad de muestra inyectada [14].

Las condiciones experimentales para realizar HS-GC/MS se encuentran en la siguiente tabla.

Para preparar el ISTD se utilizó una solución de 4-metylpentan-2-ol a una concentración de 100 μg/ml.

Se prepararon las series de calibrado A (tabla 3), B (tabla 4) y C (tabla 5), que contenían los componentes volátiles que queríamos cuantificar en nuestras muestras.

Tanto a las muestras como a las series de calibrado se les añadió el ISTD.

El instrumento utilizado para analizarlas fue el Sistema 7890A GC, acoplado con el sistema GC-MS 7000 Series Triple Quadrupole, de la casa comercial Agilent. El software para conseguir y analizar los datos fue MassHunter.

Los resultados obtenidos en ng/ml fueron transformados a partes por millón (ppm) para una mejor interpretación.

Cromatografía líquida acoplada a espectrofotomería de masas (LC-MS)
para el análisis de azúcares

Un sistema de cromatografía líquida acoplada a espectrofotometría de masas (LC-MS) contiene una interfaz que transfiere los componentes separados de la columna cromatográfica a la fuente de iones MS. La interfaz es necesaria porque los dispositivos LC y MS son fundamentalmente incompatibles, ya que la fase móvil en un sistema de LC es un líquido presurizado y en los analizadores de MS se opera normalmente bajo vacío [15].

Gracias a esta técnica es posible realizar un análisis de los componentes líquidos en la fermentación de la cerveza, analizando así la presencia de azúcares como la maltotriosa, el segundo azúcar más abundante del mosto de cerveza, que es utilizado por las levaduras para crecer y desarrollarse y producir así el proceso de fermentación [6].

Las condiciones experimentales para realizar la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas se muestran en la siguiente tabla.

Se utilizó un control de calidad (QC), consistente en una mezcla de todas las muestras que se iban a analizar, proporcionando así un promedio de todos los metabolitos contenido en ellas. También realizamos un blanco, el cual solo contenía agua. Y por último, una mezcla de azúcares, cuya composición se puede observar en la tabla 7. Todos estos preparados debían ser inyectados cada diez muestras.

En la preparación de las muestras que debían analizarse se añadía acetonitrilo puro, para la eliminación de proteínas. Las muestras eran almacenadas a –20 ºC hasta su procesado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cultivos de levaduras

A partir de la observación de las cepas puras tuvimos sospechas de que la cepa NFAY 31 no era levadura, puesto que las escasas colonias eran casi invisibles y demasiado pequeñas, teniendo así una forma más parecida a la de la bacteria. Desde ese momento dejamos a esta cepa fuera del experimento.

Para los cultivos NFAY 29, NFAY 30 y NFAY 32 se obtuvieron colonias con aspecto propio de levadura, de las cuales se escogieron distintas colonias para comprobar que los resultados eran reproducibles. Por lo tanto, al final obtuvimos tres cepas de NFAY 29 (NFAY 29.1, NFAY 29.2 y NFAY 29.3), otras tres de NFAY 30 (NFAY 30.1.1, NFAY 30.1.2 y NFAY 30.2) y cuatro de NFAY 32 (NFAY 32.1.1, NFAY 32.1.2, NFAY 32.2.1 y NFAY 32.2.2).

El color y la morfología de las levaduras en el medio Wallerstein Laboratories Nutrient Agar (WLN) no son decisivos para clasificarlas, pero sí que ofrecen una ligera idea acerca de con qué cepas se está trabajando. Analizando las placas se podía intuir que todas ellas eran del género Saccharomyces, por sus colores y morfologías. Sin embargo, podrían pertenecer a distintas especies. Por su color verde claro-blanco, podíamos aventurar que todas las cepas del cultivo NFAY 32 y los controles WLP500 y G561 eran Saccharomyces cerevisiae. Sabíamos previamente que WLP013 y WLP500 eran S. cerevisiae, lo cual nos proporcionó una mayor fiabilidad [16].

En cuanto a NFAY 30 y WLP013, observamos un color verde botella que es indicativo de levaduras fenólicas, es decir, levaduras que producen fenoles, compuestos orgánicos aromáticos.

Las cepas del cultivo NFAY 29 y NCYC 456 poseían un aspecto aplanado, lo que podía significar que no pertenecían a la especie cerevisiae. Sabíamos que esto era acertado, al menos para NCYC 456, ya que era un control correspondiente a Saccharomyces pastorianus, lo cual concordaba con el resultado de la placa [17].

En cuanto a las placas preparadas con Wallerstein Laboratories Differential Agar (WLD) no se obtuvo ningún tipo de colonia, por lo que no tuvimos motivos para sospechar que ninguna de las muestras contuviese bacteria.

Análisis genéticos

Para realizar los análisis genéticos se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN. Se obtuvo banda de ADN en gel de electroforesis para las regiones ITS, LSU1 y LSU2 de todas las cepas. Sin embargo, para AGT1 se obtuvo banda de ADN para todas excepto la NFAY 32.2.1.

Los resultados de la secuenciación para las regiones LSU 1 y LSU 2 fueron concluyentes para todas las cepas. Pertenecían al género Saccharomyces con una fiabilidad mayor del 99 %.

En cuanto a ITS, para las muestras del cultivo NFAY 29 no se consiguieron buenos resultados. Que la secuenciación del ADN de la región ITS en NFAY 29 fuese fallida podía deberse a que se tratara de una cepa híbrida, ya que como Kopecká et al. [18] sugirieron, múltiples tipos de regiones ITS en cepas de cerveza híbridas pueden hacer que su análisis sea más costoso.

Sin embargo, se observó con una fiabilidad mayor del 98 % que NFAY 30 pertenecía a Saccharomyces boulardii.

Se trataba de un resultado muy interesante, ya que Czerucka et al. [19] demostraron en su trabajo que S. boulardii es una levadura potencial para la fabricación de probióticos.

En lo que respecta al cultivo NFAY 32, se trataba de S. cerevisiae con una fiabilidad mayor del 90 %. Además, este resultado concordaba con las pruebas anteriormente realizadas con el medio WLN, donde ya podíamos intuir que correspondía a S. cerevisiae.

En cuanto al análisis de AGT1, sabíamos que la expresión potenciada de AGT1 estaba relacionada con una mayor captación de maltotriosa en levaduras Ale, mientras que en Lager está mutado [11].

Las levaduras Lager tienen mutaciones de desplazamiento de marco de lectura en AGT1. Para analizar si nuestras cepas poseían la mutación o no estudiamos la posición número 1183, posición que Vidgren, Ruohonen y Londesborough [20] describieron como el lugar donde comienza la mutación que produce el cambio de marco de lectura.

En la tabla 8 se puede ver de manera clara si el gen está presente, ausente o defectivo, es decir, presente pero mutado.

Como hemos mencionado, no obtuvimos resultado de banda de ADN en el gel de electroforesis para NFAY 32.2.1, lo cual resultaba extraño, ya que las demás cepas provenientes del mismo cultivo sí lo poseían. Esto nos hizo pensar que quizás hubo algún problema en el análisis genético, aunque era poco probable, ya que las cepas tenían un aspecto morfológico similar. Este resultado también pudo ser debido a que fuesen cepas distintas y poseyese, en lugar de AGT1 como transportador principal de maltotriosa, otro transportador [21].

Respecto al resto de muestras, las provenientes del cultivo NFAY 29 y NCYC 456 tenían la T adicional, lo que las convertía en cepas mutadas.

En concreto, NCYC 456 se trata de una cepa comercial domesticada, por lo que no es de extrañar que posea la mutación, puesto que se ha descrito que la delección de este gen es propia y beneficiosa para levaduras Lager [22].

En cuanto a NFAY 29, Gallone et al. [6] obtuvieron en su estudio que alrededor del 25 % de sus levaduras S. cerevisiae (Ale) también poseían la T extra, lo que nos llevaba a reafirmar la teoría que está tomando cada vez más consideración, que esta mutación, aunque sí es más característica de Lager, no es exclusiva de estas.

Identificación de componentes volátiles tras la fermentación

Con objeto de examinar los componentes volátiles que contribuyen al aroma y sabor de la cerveza se realizó HS-GC/MS en las muestras tras la fermentación a 22 y 35 ºC para cuantificar 15 compuestos diferentes: butan-1-ol, acetato de propilo, 1,1 dietoxietano (más comunmente conocido como acetal), propionato de etilo, actato de isobutilo, butirato de etilo, 3-metilbutan-1-ol acetato, propano-1-ol, acetato de etilo, 2-metilpropan1-ol, 3metilbutan-1-ol, 2-metilbutan-1-ol, etil hexanoato, etil octanoato y etil decanoato. En cuanto a los tres últimos componentes, T. Zambrano y M. Raigón [23] los identifican en su estudio como componentes relevantes en la fermentación de la cerveza. Sin embargo, en nuestro experimento no se obtuvo suficiente cantidad en las muestras para que fuese representativo.

Gracias a los trabajos de Baxter y Hughes [24] y Maarse [25] sabemos qué aroma produce cada componente, por lo que podemos deducir qué tipo de aroma producirá cada una de nuestras levaduras de acuerdo con el tipo de componentes que producen.

De forma general, hay sabores que no suelen ser deseables, mientras que hay otros por los que se puede tener preferencias. Entre los sabores que podemos encontrar indeseables se encuentran los sabores ácidos, como el que puede producir la manzana en ocasiones, o el sabor amargo.

Las cervezas Ale tienden a ser afrutadas, y los ésteres son los que proporcionan mayoritariamente este aroma, por lo que es de esperar que nuestras muestras contengan gran cantidad de ésteres [26].

Pudimos observar que WLP500 fermentó mejor a 22 ºC. A esta temperatura se obtuvo una clara influencia de ésteres que aportan aromas de banana, piña o pera, es decir, un aroma más afrutado. Sin embargo, a 35 ºC tenía más concentración de componentes que proporcionan aroma manzana, que como ya hemos mencionado puede desembocar en un sabor desagradable. De esta cepa control conocíamos que su fermentación óptima era alrededor de 20 ºC, hecho que pudimos corroborar tras realizar el experimento [16].

De acuerdo con la compañía White Labs, pudimos afirmar que WLP013 fermentaba mejor a 22 ºC, produciendo a 35 ºC una concentración alta de acetal, lo que podría desembocar en un sabor amargo [16].

NCYC 456 obtuvo una fermentación baja en comparación con las demás. Sin embargo, el simple hecho de que fermentase fue sorprendente, ya que las levaduras Lager no soportan temperaturas de 35 °C [18].

G561 se trataba de una cepa silvestre, por lo que no teníamos datos previos. El resultado fue una buena fermentación sin diferencias destacables entre ambas temperaturas experimentales, con posibilidad de obtener un sabor amargo por la presencia de acetal en ambas.

Pese a que las cepas de NFAY 29 fermentaron todas de manera muy similar, podríamos destacar que lo hicieron mejor a 35 ºC. Los componentes que predominaron son los que ofrecen aromas afrutados.

En cuanto a las cepas de NFAY 30 produjeron una fermentación similar a 22 y a 35 ºC. Sin embargo, podríamos destacar una mayor presencia de acetal a 35 ºC, lo que podría ser indicativo de un sabor más amargo a esta temperatura que a 22 ºC.

Por último, respecto a las cepas del cultivo NFAY 32 podemos decir que fermentaron mejor con carácter general a 35 ºC, ya que produjo más altas concentraciones de los componentes.

Determinación de maltotriosa en la cerveza

Procesamos los resultados con el programa Progenesis y pudimos obtener información de todos los componentes líquidos presentes en la cerveza. Para la interpretación de los resultados realizamos un diagrama de análisis de componentes principales (PCA), realizado con el software Unscrambler X, que podemos observar en la figura 1. El algoritmo utilizado fue el de Descomposición en valores singulares (SVD). El PCA nos ayudó a apreciar de manera global cómo utilizaron las cepas los azúcares presentes en la cerveza. En él pudimos observar la presencia de las muestras, los controles, los controles de calidad (QC), la mezcla de azúcares y los blancos.

Los puntos blancos estaban muy alejados de las muestras, alguno de ellos incluso fuera del rango de metabolitos, lo cual fue positivo, ya que su composición era exclusivamente agua. En cuanto a las mezclas de azúcares, los obtuvimos dentro del rango de metabolitos, lo que era esperado ya que contenía los azúcares que debían analizarse. Por otro lado, es importante señalar que el hecho de que no se encontrasen cerca de las muestras no fue indicativo de que las muestras no poseyeran azúcares, sino de que las muestras no contuvieran exclusivamente azúcares, pues también poseían otros compuestos hidrosolubles.

En lo que respecta a las muestras, que estuvieran todas solapadas y dentro del rango de metabolitos era indicativo de que, en general, tenían la misma fracción hidrosoluble. Las cepas control y la mayoría de controles de calidad (QC) no se podían apreciar porque estaban solapadas por debajo de las muestras. En la figura 2 encontramos el mismo PCA con ampliación en la zona de las muestras, para así observar las cepas control y QC.

En el PCA ampliado pudimos observar la presencia de las muestras, las cepas control y los controles de calidad. Que las cepas experimentales y las cepas control estuvieran solapadas significaba que tenían la misma fracción hidrosoluble. Puesto que los QC consistían en una mezlca de todas las muestras, era lógico que se encontraran cerca de estas.

Realizamos además otro PCA para el análisis de los cien componentes más abundantes de las muestras (figura 3). Esto nos reveló que la fracción líquida de la cerveza era diferente para las muestras que habían fermentado a 22 °C y las que lo habían hecho a 35 ºC.

Por otro lado, se analizó exclusivamente el componente de la maltotriosa con el programa Progenesis, lo que resultó de gran interés puesto que habíamos realizado previamente análisis genéticos del transportador de alfa glucósido (AGT1).

Se examinó de este modo qué muestras tenían más maltotriosa presente y, por lo tanto, la utilizaban menos en la fermentación. Este análisis se puede ver en la siguiente figura.

Estos perfiles de abundancia normalizados no eran cuantitativos, pero fueron útiles para comparar las muestras entre ellas.

Las cepas del cultivo NFAY 29 fueron las que utilizaron la maltotriosa de un modo más eficiente en la fermentación a ambas temperaturas. Esto fue muy interesante porque sabíamos que tenían AGT1 mutado. No averiguamos la especie a la que pertenecían y podrían ser Lager, lo cual tendría sentido porque significaría que otro transportador diferente a AGT1 sería el encargado de la maltotriosa. Sin embargo, esto fue dudoso, ya que las cepas del cultivo NFAY 29 fermentaron mejor a 35 ºC y las Lager fermentan mejor a temperaturas más bajas.

En cuanto a las cepas del cultivo NFAY 30, todas ellas utilizaban la maltotriosa igual de eficientemente a ambas temperaturas, exceptuando NFAY 30.2, que a 22 ºC no la utilizó.

Las cepas del cultivo 32 utilizaron notoriamente la maltotriosa de manera más eficaz a 35 que a 22 ºC. Durante los análisis genéticos concluimos que la cepa NFAY 32.2.1 no poseía AGT1. Sin embargo, pudimos observar que utiliza la maltotriosa con igual eficacia que el resto de cepas de su cultivo, lo que reforzaba la teoría que ha tomado más fuerza recientemente, que la mutación en AGT1 no es exclusiva de Lager pues algunas levaduras Ale pueden poseerla también.

En las muestras fermentadas con la levadura G561 se encontró presente una cantidad considerable de maltotriosa, lo que indicaba que no la utilizó de un modo óptimo.

El resultado de NCYC 456 nos informó de que utilizó la maltotriosa mejor a 22 ºC. Este resultado era el esperado, puesto que se trata de una cepa Lager, y aunque tenía AGT1 mutado, se han encontraron otros tres tipos de transportadores de maltotriosa en levadura Lager.

CONCLUSIONES

Mediante la identificación de las cepas podemos llegar a la conclusión de que las cepas pertenecientes al cultivo NFAY 30, que corresponden a Saccharomyces boulardii, podrían ser muy prometedoras en el sector de creciente interés de los alimentos probióticos. Al tratarse de una cepa de levadura probiótica, podría emplearse para la fabricación de una cerveza probiótica, que conferiría propiedades beneficiosas para la salud.

También es muy interesante el hecho de que existen levaduras que son generalmente capaces de fermentar la maltotriosa pero que contienen varias mutaciones de desplazamiento de marco de lectura en MAL11, como es el caso de NFAY 29. Además, con el resultado obtenido de la cepa NFAY 32.2.1, apoyamos la teoría de que la mutación en AGT1 no es exclusiva, aunque sí predominante, de levaduras Lager.

Por otro lado, la influencia de la temperatura en el perfil del sabor es notoria. Las cepas NFAY producen componentes volátiles que podrían aportar sabores únicos gracias a su buena fermentación a 35 ºC. También podemos destacar la diferencia entre la utilización de maltotriosa por parte de las cepas a ambas temperaturas, siendo también mejor a altas temperaturas.

Como propuesta de futuro sería muy interesante analizar, mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), componentes como el glicerol y ácido acético, ya que se ha descrito que son componentes producidos en abundancia en la cerveza y tienen gran influencia en el sabor y aroma. Finalmemte se propondría estudiar si existe una correlación entre los resultados experimentales y las propiedades organolépticas de la bebida obtenida.

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ANEXO

Receta para la producción de cerveza