Nereis. Interdisciplinary Ibero-American Journal of Methods, Modelling and Simulation.

INTRODUCCIÓN

Según distintos estudios realizados hasta la fecha, el consumo de vegetales de la familia de las crucíferas está relacionado con diferentes efectos beneficiosos para la salud, como una actividad anticancerígena o antiinflamatoria. Esto se debe a su alto contenido en compuestos bioactivos, como los glucosinolatos y sus derivados, los isotiocinatos, así como los compuestos fenólicos [1-3]. En este sentido, el consumo de brotes de brócoli proporciona una fuente muy interesante de nutrientes y fitoquímicos en nuestra dieta, ya que pueden presentar una concentración hasta veinte veces superior en bioactivos que el vegetal adulto [4, 5].

Muchas de las actividades biológicas de estos brotes están relacionadas con la presencia de sulforafano, el isotiocianato procedente de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina. Este compuesto se metaboliza a través de la ruta del ácido mercaptúrico en los enterocitos, uniéndose al glutatión y derivados de la cisteína, los cuales se han encontrado en plasma y orina en niveles cuantificables [6]. El sulforafano y sus metabolitos son capaces de inducir actividades enzimáticas como las de detoxificación (enzimas de tipo Fase II), así como otros efectos antincancerígenos como inhibición del ciclo celular y apoptosis [7, 8]. Además, estos compuestos se han relacionado con una acción antinflamatoria y antioxidante en la célula, inhibiendo el factor NF-ĸB responsable de la expresión de iNOS, COX-2 y del factor THF-á, mecanismos implicados en la inflamación celular y, por lo tanto, previniendo o reduciendo el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas [9].

No obstante, además de estos estudios, todavía se necesita investigar con detenimiento los mecanismos de acción del sulforafano. Es por ello por lo que en este trabajo se evalúa el efecto antiproliferativo de los brotes de brócoli como matriz vegetal completa, así como de los fitoquímicos puros: la glucorafanina (principal glucosinolato del brócoli) y el sulforafano (isotiocianato derivado del anterior), en líneas celulares de cáncer humano colorrectal (Caco-2 y HT-29) y hepático (HepG2), comparando los efectos de una matriz vegetal con sus compuestos bioactivos puros. Por otro lado, se investiga una acción antinociceptiva (analgésica) en modelos de roedores (in vivo), abriendo una línea de investigación con el objetivo de promover el uso de fitoquímicos como alternativa al uso de medicamentos analgésicos con efectos secundarios.

MATERIALES Y MÉTODOS

Germinación de brotes de brócoli

Las semillas de brotes de brócoli (Brassica oleracea var. italica) se adquirieron en la empresa Intersemillas, S. A. (Valencia, España). La producción de estos brotes se realizó en las cámaras de cultivo controladas del CEBAS-CSIC, con las siguientes condiciones: ciclos de luz/oscuridad de 16/8 h, temperaturas de 25 y 20 °C y humedad relativa del 60 y 80 %, respectivamente, radiación PAR 400 µmol/m·s mediante tubos fluorescentes (Philips TLD 36 W/83, Hamburgo, Alemania) y lámparas de haluro metálico (Osram HQI.T 400 W, Múnich, Alemania). La germinación de los brotes se realizó, en primer lugar, mediante hidratación y aireación de las semillas durante 24 h en agua con 5 g/L de hipoclorito sódico para su activación y desinfección. A continuación, se extendieron sobre celulosa (CN SEEDS Ldt, Inglaterra) 10 g de semillas hidratadas por bandeja de 12 x 7 cm y se trasladaron a la cámara de cultivo controlada. Allí se mantuvieron en oscuridad durante los primeros tres días, y a partir del cuarto día de germinación se expusieron al ciclo de luz/oscuridad hasta el octavo día, cuando se recogieron, pesaron, congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 °C. Por último, los brotes se liofilizaron y molieron para realizar su extracción. Cada bandeja de brotes (n = 3) corresponde a un replicado de una muestra (tres bandejas son tres réplicas de una misma muestra).

Extracción y determinación de glucosinolatos en brotes de brócoli

Cada muestra liofilizada (50 mg), perteneciente a una bandeja de brotes, se extrajo con 1 ml de MeOH:H₂O (70:30). Las muestras se incubaron a 70 °C durante 30 min, para desactivar la enzima mirosinasa. Tras centrifugar las muestras, el extractante se evaporó en un evaporador rotarorio y el residuo sólido se disolvió en H₂O para su posterior análisis cromatográfico. Las muestras se filtraron por una membrana de PVDF de 0,45 µm (Millex) y se analizaron por HPLC-DAD-MS/MS en los laboratorios del CEBAS-CSIC, mediante el método descrito por Baenas et al. para la efectiva identificación y cuantificación de los glucosinolatos [10].

Extracción y determinación de isotiocianatos en brotes de brócoli

Cada muestra liofilizada (50 mg) se extrajo con 1,5 ml de H₂O. Las muestras se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente (25 °C), en agitación para conseguir la hidrólisis de los glucosinolatos a isotiocianatos [11]. Tras centrifugar las muestras, estas se filtraron por una membrana de PVDF de 0,45 µm (Millex) y se analizaron por UHPLC-MS/MS-QqQ, mediante el método descrito por Dominguez-Perles et al. para la identificación y cuantificación de los isotiocianatos [12].

Preparación de extractos acuosos para el análisis de bioactividad

La evaluación de la bioactividad se realizó empleando métodos in vitro e in vivo.

En primer lugar, los brotes de brócoli liofilizados y molidos se sometieron a una extracción acuosa siguiendo el método de Cramer y Jeffery (2011) a gran escala, consistiendo en la extracción de 25 g de material vegetal en 400 ml de agua, que se centrifugaron durante 10 min a 3.000 rpm. Posteriormente se filtraron por papel de filtro de tipo Albert 400. A continuación, este extracto acuoso se liofilizó y se almacenó en un desecador, libre de humedad y en oscuridad, hasta su uso.

Evaluación del efecto antiproliferativo in vitro en cultivos celulares

Se empleó el método colorimétrico MTT [13] y tres cultivos celulares: Caco-2 y HT-29 (líneas celulares de cáncer intestinal) y HepG2 (línea celular de cáncer hepático). Se expusieron a diferentes concentraciones de sulforafano puro (100-10 µmol/L), glucorafanina (100-10 µmol/L) y extracto acuoso de brotes de brócoli (20-0,05 µmol/L) durante 24 h, para determinar el efecto inhibidor de dichas muestras en la proliferación de estas células, mediante el cálculo de la IC₅₀ (concentración de la muestra que produce una inhibición del crecimiento celular del 50 %).

Evaluación del efecto analgésico in vivo en roedores

Mediante la realización de un extracto acuoso del material vegetal liofilizado, se evaluó el efecto antinociceptivo (analgésico) de los brotes de brócoli, por medio de dos tipos de test de nocicepción (proceso neuronal mediante el cual se codifican y procesan los estímulos potencialmente dañinos contra los tejidos) en roedores [14]: test de la formalina en ratas Wistar [15] y test de estiramientos en ratones albinos Swiss [16]. Para ello se emplearon las dosis 500, 1000 y 2000 mg/kg del extracto acuoso liofilizado, diluido en agua, y se administraron con una sonda orogástrica o cánula directamente al estómago de los roedores, con el fin de controlar la dosis aplicada. Este tratamiento se administró 30 min antes del inicio de los tests de nocicepción.

Métodos estadísticos

Todos los análisis se realizaron por triplicado. El cálculo de la IC₅₀ se llevó a cabo con el programa Graphpad Prism (IBM Corp, NY, USA); y las diferencias significativas entre valores correspondientes a más de dos muestras se calcularon mediante un ANOVA (P < 0,05) con el programa SPSS 15.0 (LEAD Technologies, Chicago, USA).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Contenido en compuestos bioactivos de los brotes de brócoli

La caracterización en compuestos bioactivos (glucosinolatos e isotiocianatos) del material vegetal se llevó a cabo con anterioridad al diseño de los experimentos de evaluación de la bioactividad, con el objetivo de escoger las dosis apropiadas del extracto acuoso de brotes de brócoli, con un contenido en compuestos conocido. Los brotes seleccionados se recogieron a los ocho días de germinación, habiéndose establecido dicho periodo de tiempo como óptimo para su consumo en trabajos previos, debido a un tamaño apropiado y a su alto contenido en compuestos bioactivos [10]. En el extracto hidrometanólico, preparado con el objetivo de desactivar la enzima mirosinasa responsable de la hidrólisis de los glucosinolatos a isotiocianatos, se encontró una elevada concentración de glucosinolatos (40,25 mg/g brotes de brócoli P.S.) (tabla 1), en comparación con el contenido de estos compuestos en vegetables maduros, como la pella de brócoli (~8 mg/g P.S.) [17]. Del total de glucosinolatos, se observó que el 40 % correspondía a la glucorafanina, cuyo producto de hidrólisis, el sulforafano, posee diferentes bioactividades in vitro e in vivo, como actividad antioxidante, antiproliferativa y antinflamatoria, a través de la modulación de mecanismos y expresión de ciertas enzimas y genes relacionados con enfermedades crónicas y ciertos cánceres [9, 18].

Tras realizar la hidrólisis de la glucorafanina por la enzima mirosinasa mediante la extracción acuosa, el contenido en sulforafano en el extracto acuoso fue de 0,95 mg/g brotes de brócoli (tabla 1). En los brotes también se analizaron el isotiocianato iberina (0,026 mg/g), producto de hidrólisis de la glucoiberina, y el indol-3-carbinol (0,013 mg/g), producto de hidrólisis de glucosinolatos de tipo indólico, pues ambos isotiocianatos también contribuyen a la bioactividad de este alimento, debido a su actividad antioxidante y anticancerígena, según diversos estudios [8,19].

Efecto antiproliferativo en células cancerígenas intestinales (Caco-2 y HT-29) y hepáticas (HepG2) humanas

Los resultados indican que el efecto antiproliferativo del extracto de brotes de brócoli, como matriz alimentaria, y del sulforafano es dosis-dependiente. Sin embargo, no es así en el caso del tratamiento con glucorafanina, con el cual no se alcanza la inhibición del 50 % del crecimiento celular (IC50). En la figura 1 se puede observar la inhibición del crecimiento de las líneas celulares tras los tratamientos realizados con sulforafano como compuesto puro (100-10 µmol/L), glucorafanina como compuesto puro (100-10 µmol/L) y el extracto acuoso de brotes de brócoli (conteniendo 20-0,05 µmol/L de sulforafano).

Estos resultados indican que es necesaria la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina al isotiocianato sulforafano para obtener el efecto bioactivo, en este caso la actividad antiproliferativa, de acuerdo con otros autores [20]. La IC₅₀ más baja que hemos obtenido ha sido con el tratamiento de brotes de brócoli, siendo de 1,6 y 3,2 µmol/L en ambas Caco-2 y HT-29, y en HepG2, respectivamente (figura 1). Estos resultados nos indican que, aunque los brotes de brócoli contienen menor cantidad de sulforafano en comparación con la aplicación del compuesto puro, el efecto del alimento completo, con la presencia de otros compuestos bioactivos como compuestos fenólicos o vitaminas, actúa biológicamente de forma sinérgica, incrementando la bioactividad de esta muestra y no interfiriendo con la actividad del sulforafano presente en los brotes [20].

Efecto analgésico de brotes de brócoli en modelos de roedores

Antes de la realización de los test de nocicepción se administró a los roedores el extracto acuoso de brotes de brócoli liofilizado y disuelto en agua, empleando una cánula para proporcionarles las dosis orales de 500, 1.000 y 2.000 mg/kg 30 min antes. Los resultados obtenidos, tras realizar el test, indican una disminución del dolor en las ratas con el tratamiento, tanto en la primera fase (fase neurogénica) durante los primeros 5 min (figura 2.A-B.), como en la segunda (fase inflamatoria), de 20 a 25 min (figura 2.C-D.).

En cada una de las fases se evaluó la cantidad de veces que la rata agitaba la pata debido al dolor causado por un agente nocivo, inyectado en la zona subplantar, y el tiempo de lamidas que el animal realizaba en este lugar, siendo en general estos resultados significativos estadísticamente con las dosis de 1.000 y 2.000 mg/kg, donde encontramos una reducción de estos parámetros (figura 2).

En el caso del test de estiramientos en ratones, observamos que el efecto tanto en el tiempo de latencia hasta el primer estiramiento, como en el número total de estiramientos abdominales, fue dosis-dependiente, pues encontramos diferencias significativas en el aumento del tiempo de latencia para las dosis de 1.000 y 2.000 mg/kg en los ratones tratados (figura 3.A.), y tras proporcionar las tres dosis orales en el número total de estiramientos abdominales (figura 3.B.).

Por lo tanto, el extracto de brotes de brócoli liofilizados modula tanto la fase neurogénica del dolor o dolor agudo, debido a la activación del sistema nervioso periférico, como la fase inflamatoria, responsable del dolor a nivel del sistema nervioso central. No obstante, la disminución del dolor es superior en la primera fase, posiblemente debido a una acción de tipo opiácea del tratamiento [20], así como una acción analgésica debido al bloqueo de mecanismos inflamatorios a nivel periférico [21,22].

CONCLUSIONES

Es importante, antes de realizar un estudio in vitro o in vivo, caracterizar el material vegetal que se va a utilizar para los tratamientos, con el objetivo de identificar y cuantificar los compuestos bioactivos, presentes en este, que puedan tener efecto beneficioso para la salud.

Con este trabajo se ha demostrado que se puede estudiar la biodisponibilidad y bioactividad del sulforafano en células cancerígenas humanas, uno de los responsables del efecto antiproliferativo de los brotes de brócoli en este modelo in vitro. Por otro lado, se ha demostrado el efecto analgésico de estos brotes en modelos de roedores, pudiendo utilizarse como tratamiento y evitar así los efectos secundarios de los medicamentos usados normalmente. Así mismo, se requiere el estudio de los mecanismos de acción de los compuestos bioactivos presentes en los brotes de brócoli, como antiinflamatorio, anticancerígeno y antioxidante, para determinar cómo afectan al metabolismo humano y a la prevención del desarrollo de enfermedades.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se ha financiado mediante el proyecto AGL2013-46247-P, del Ministerio de Economía y Competitividad (España), y parcialmente a través de la Red Temática CORNUCOPIA (Ref. 112RT0460), dentro del programa CYTED (España). N. Baenas fue beneficiaria de una beca FPU del Ministerio de Educación (España).

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